2017. november 21. kedd
Olivér
Biotechnológia, molekuláris biológia és élettan az mRNS.hu-n

Az info@mrns.hu-ra küldhet linket vagy valamilyen anyagot, amit szeretne, ha hírként bemutatnánk.


Korábbi híreink  |   Keresés:

Kiválasztott hír:
Megosztás: Add az iWiW-hez Add a Facebook-hoz Add a Twitter-hez Add a Google Reader-hez Add a Startlaphoz
Evolúciós módszerek a fehérjék kölcsönhatásainak vizsgálatában 4. rész - fXII inhibitorok fejlesztése fág bemutatással - 2014-02-11 12:19:46 Hozzászólás írása Hozzászólások száma 0 hozzászólás 
Evolúciós módszerek a fehérjék kölcsönhatásainak vizsgálatában 4. rész - fXII inhibitorok fejlesztése fág bemutatással

A sorozat első három részében (Evolúciós módszerek a fehérjék kölcsönhatásainak vizsgálatában 1. rész, Evolúciós módszerek a fehérjék kölcsönhatásainak vizsgálatában 2. rész – A fág bemutatás, Evolúciós módszerek a fehérjék kölcsönhatásainak vizsgálatában 3. rész – A fág bemutatás alkalmazása szerin proteázok és kanonikus szerin proteáz inhibitorok kölcsönhatásának vizsgálatában) bemutattam az irányított evolúciós megközelítést, annak legelterjedtebben alkalmazott eljárását, a fág bemutatást, valamint a fág bemutatás alkalmazását szerin proteázok és kanonikus szerin proteáz inhibitorok kölcsönhatásainak vizsgálatában. Ebben a részben a véralvadás XII-es faktorát hatékonyan és specifikusan gátló inhibitorok kifejlesztését és a fXII működésének és szerepének jobb megértését célzó kutatási projektem mutatom be.

A véralvadás egy finoman szabályozott folyamat. Létfontosságú, hogy csak az érpálya és a környező szövetek sérülésekor, és csak a sérülés közelében játszódjon le. A véralvadás során több tucat fehérje működik együtt összehangoltan. A véralvadás folyamatában szereplő molekulák aktiváló és gátló kölcsönhatásokon keresztül szabályozzák egymás működését. A folyamat végső soron fibrin keletkezéséhez vezet. Ez a molekula alakítja ki azt a „hálót”, ami a keletkező véralvadék vázát adja. A véralvadási rendszer működésének zavarai vérzékenységet vagy fokozott alvadékonyságot okozhatnak. A nyugati országokban a vezető halálokok között tartják számon a trombózissal összefüggő betegségeket. Ezeket a betegségeket az okozza, hogy az érpályában kialakuló vérrögök elzárják a véráramlást egy létfontosságú szervben. Az érintett szervtől függően ilyen betegségek az iszkémiás stroke, a szívinfarktus és a tüdőembólia. Ezért kiemelkedően fontos a véralvadás folyamatainak molekuláris szintű megismerése, a lehetséges beavatkozási pontok azonosítása és a célzott terápiát lehetővé tevő gyógyszerek fejlesztése.

 

1. ábra. A véralvadási rendszer. A véralvadás XII-es faktora a belső (intrinsic) útvonal aktiváló enzime. Jelenlegi ismereteink szerint a fXII nem nélkülözhetetlen a normális véralvadáshoz, viszont szerepet játszik súlyos trombotikus betegségek kialakulásában, valamint hozzájárul gyulladásos és allergiás folyamatokhoz is. Ezért a fXII potenciális gyógyszer célpont molekula. Forrás
 

A véralvadás XII-es faktora (fXII) több más véralvadási faktorhoz hasonlóan többdoménes fehérje, ami a C-terminálisán egy szerin proteáz doménnel rendelkezik. A véralvadási rendszerről alkotott klasszikus ismeretek szerint a fXII a véralvadás belső vagy kontakt aktivációs útvonalának elindításáért felelős. Negatívan töltött mesterséges felszínekkel (például kaolin vagy dextrán-szulfát) érintkezve a fXII szerin proteáz doménje aktiválódik. Az aktiválódott fXII legfontosabb szubsztrátja két inaktív szerin proteáz előalak: a prekallikrein és a véralvadás XI-es faktora (fXI).

Az aktivált fXI a véralvadási kaszkád beindításáért felelős (lásd 1. ábra). A fXII hiánya a véralvadás belső útvonalának épségét jellemző tesztben kapott érték, az aktivált parciális tromboplasztin idő megnövekedésével jár. Azaz a fXII aktivitása a teszt során alkalmazott körülmények között nélkülözhetetlen a fibrin képződéshez. Ezzel ellentmondásban van, hogy a fXII hiánya nem jár együtt vérzékenységgel, a csökkent fXII aktivitással rendelkező betegeken akár komoly műtéti beavatkozások is elvégezhetők. Vagyis a fXII nem szükséges a szervezetet ért sérülések esetén a normális véralvadáshoz. A jelenség magyarázata az, hogy a fXI leghatékonyabb aktivátora in vivo a véralvadási rendszer központi enzime, a trombin. A belső útvonal tehát nem elsősorban a véralvadás független útvonalaként működik, szerepe a véralvadásban inkább egy trombin által aktivált erősítő hurokként képzelhető el (Gailani és Broze 1991; Matafonov és mtsai. 2011).

Az elmúlt évtizedben fXII-t nem termelő egerekben kimutatták, hogy ezek az állatok védettek több vérrögképződéssel összefüggő betegség kialakulásával szemben (Renne és mtsai. 2005). Később azt is felismerték, hogy a fXII részt vesz a keletkező vérrög szerkezetének stabilizálásában. Ez olyan, nehezen lebomló, masszív vérrögök kialakulásához vezet, amelyek képesek vérereket elzárni, és így súlyos trombotikus betegséget okozni. Fontos, hogy ez a hatás nem függ a trombin jelenlététől, ugyanis olyan trombin mentes szérumban is megfigyelhető, amiben az alvadást kígyóméreg proteázzal indították el. Vagyis a fXII nem trombin aktiválás révén járul hozzá a vérrög képződéshez, hanem a keletkező vérrög szerkezetét modulálja (Konings és mtsai. 2011). Ezek az eredmények ígéretes gyógyszercélpont molekulává tették a fXII-t. Gátlásán keresztül ugyanis lehetőség nyílhat a kóros vérrögképződést úgy gátolni, hogy közben a fizikai sérülések helyén szükséges véralvadás képessége nem sérül.

A fXII-nek a véralvadás mellett szerepe van a gyulladásos mediátor bradykinin felszabadításában is. A fXII által aktivált plazma kallikrein pozitív visszacsatolással további fXII-t aktivál, valamint bradykinint szabadít fel a nagy molekulatömegű kininogén hasítása által. Ez a három fehérje, a fXII, a plazma kallikrein és a nagy molekulatömegű kininogén alkotja az úgynevezett kontakt rendszert (Colman és Schmaier 1997). A bradykinin gyulladásos folyamatokért felelős jelátviteli útvonalakat aktivál, aminek következménye az erek tágulása, az érfal átjárhatóságának növekedése és neutrofil granulociták toborzása.
 


2. ábra. A kontakt rendszer sematikus képe. A véralvadás XII-es faktora negatív töltésű mesterséges felszínekkel (pl. üveg, kaolin, dextrán-szulfát) vagy a szervezetben is előforduló molekulákkal (pl. polifoszfát, heparin, RNS) érintkezve aktiválódik. A fXII aktiválja a plazma kallikreint. Nagy molekulatömegű kininogén (NMTK) jelenlétében a plazma kallikrein egyrészt további fXII molekulákat aktivál, másrészt az NMTK hasításával bradykinint szabadít fel. A bradykinin gyulladásos folyamatokat idéz elő.


Az örökletes angioödéma (HAE) egy ödémás rohamokkal járó betegség, ami a duzzanat helyétől és mértékétől függően életveszélyes állapotot is előidézhet. A HAE hátterében minden esetben a kontakt rendszer szabályozásának valamilyen rendellenessége húzódik meg (Zuraw 2008). A kontakt rendszer aktiválódásakor a hibás szabályozás következtében nagy mennyiségű bradykinin keletkezik, ami előidézi az ödémás duzzanatok kialakulását.

A hízósejtek által közvetített allergiás folyamatok előidézésében a hisztamin mellett a bradykinin is részt vesz. Az elmúlt években kimutatták, hogy a hízósejtek által termelt heparin in vivo is képes aktiválni a fXII-t, és általa a bradykinin felszabadulásáért felelős kontakt rendszert (Oschatz és mtsai. 2011). Ezzel összhangban van az a megfigyelés is, hogy a HAE rohamokat gyakran valamilyen allergénnel való érintkezés váltja ki (Zuraw 2008).

A fXII tehát nem csak bizonyos trombotikus betegségek megelőzésében lehet gyógyszer célpont molekula, hanem a HAE és bizonyos allergiás folyamatok is kezelhetőek lehetnek a fXII gátláson keresztül.

A természetből több fXII inhibitor fehérje is ismert. Ezek közül kettő tekinthető igazán hatékonynak. Az ecotint az Escherichia coli baktérium termeli. Ez az inhibitor számos szerin proteáz hatékony gátlására képes, azaz nem specifikus a fXII-re. A másik inhibitor, az infestin-4 a csókospoloskából (Triatoma infestans) származik. Ez nem csak hatékony, de viszonylag specifikusnak is bizonyult a fXII-re (Campos és mtsai. 2004). A kutatási projekt céljaként azt tűztem ki, hogy fág bemutatás alkalmazásával feltárom a fXII gátlását lehetővé tevő aminosav mintázatot az SGPI-2 (Schistocerca gregaria protease inhibitor 2) inhibitorból kiindulva. A feltárt mintázat rengeteg információt tartalmaz arról, hogy a fXII milyen aminosavakat preferál az inhibitor enzimmel kapcsolatban levő pozícióiban. A mintázat alapján újfajta fXII inhibitorok tervezésére és előállítására nyílik lehetőség, amelyek hatékonysága és specifikussága ideális esetben vetekedhet az infestin-4 tulajdonságaival.

Az irányított evolúciós kísérletsorozat során az SGPI-2 változatait bemutató fág könyvtárból kiválogattam azokat, amelyek képesek voltak kötni a fXII szerin proteáz doménjéhez. A kiválogatott fXII kötő klónok aminosav szekvencia mintázata alapján több újfajta inhibitort is előállítottam. Ezek mindegyike gátolja a fXII szerin proteáz doménjét, azonban hatékonyságuk elmarad az infestin-4 tulajdonságaitól, a szakirodalomban fellelhető adatoktól.

Az eddigi eredmények alapján a fXII szerkezeti biokémiai módszerekkel történő vizsgálatát tervezem. Érdekes, hogy mi lehet annak hátterében, hogy a természetből ismert illetve az irányított evolúcióval kifejlesztett fXII inhibitorok specifitása és hatékonysága nagy eltéréseket mutat. Tervezem a fXII és a fXII inhibitorok komplexeinek kristályosítását és a komplexek háromdimenziós térszerkezetének meghatározását röntgen diffrakcióval. A megismert kristályszerkezetek birtokában kideríthetjük az inhibitorok tulajdonságai között fennálló különbségek szerkezeti okait.

A kifejlesztett inhibitorok hatékonyságának és specifitásának növelésére is lehetőség van újabb irányított evolúciós kísérletekben. A megnövelt hatékonyságú inhibitorok vagy az infestin-4 alkalmazásával tervezem olyan kísérletek elvégzését is, amelyek eredményei alapján jobban megérthetjük a fXII aktiválódásának molekuláris részleteit az élő szervezetben, illetve megismerhetjük a fXII más folyamatok elindításában és szabályozásában betöltött szerepének jelentőségét.


Forrás:

Campos, Ivan T N, Anita M Tanaka-Azevedo, és Aparecida S Tanaka. 2004. „Identification and Characterization of a Novel Factor XIIa Inhibitor in the Hematophagous Insect, Triatoma Infestans (Hemiptera: Reduviidae)”. FEBS Letters 577 (3): 512–16. doi:10.1016/j.febslet.2004.10.052.
Colman, R W, és A H Schmaier. 1997. „Contact System: A Vascular Biology Modulator with Anticoagulant, Profibrinolytic, Antiadhesive, and Proinflammatory Attributes”. Blood 90 (10): 3819–43.
Gailani, D., és G. J. Broze. 1991. „Factor XI Activation in a Revised Model of Blood Coagulation”. Science 253 (5022): 909–12. doi:10.1126/science.1652157.
Konings, Joke, José W P Govers-Riemslag, Helen Philippou, Nicola J Mutch, Julian I Borissoff, Peter Allan, Sumitra Mohan, Guido Tans, Hugo Ten Cate, és Robert A S Ariëns. 2011. „Factor XIIa Regulates the Structure of the Fibrin Clot Independently of Thrombin Generation through Direct Interaction with Fibrin”. Blood 118 (14): 3942–51. doi:10.1182/blood-2011-03-339572.
Matafonov, Anton, Suryakala Sarilla, Mao-fu Sun, John P Sheehan, Vladimir Serebrov, Ingrid M Verhamme, és David Gailani. 2011. „Activation of Factor XI by Products of Prothrombin Activation”. Blood 118 (2): 437–45. doi:10.1182/blood-2010-10-312983.
Oschatz, Chris, Coen Maas, Bernd Lecher, Thomas Jansen, Jenny Björkqvist, Thomas Tradler, Reinhard Sedlmeier, et al. 2011. „Mast Cells Increase Vascular Permeability by Heparin-Initiated Bradykinin Formation In Vivo”. Immunity 34 (2): 258–68. doi:10.1016/j.immuni.2011.02.008.
Renne, Thomas, Miroslava Pozgajova, Sabine Gruner, Kai Schuh, Hans-Ulrich Pauer, Peter Burfeind, David Gailani, és Bernhard Nieswandt. 2005. „Defective thrombus formation in mice lacking coagulation factor XII”. The Journal of Experimental Medicine 202 (2): 271–81. doi:10.1084/jem.20050664.
Zuraw, Bruce L. 2008. „Hereditary Angioedema”. New England Journal of Medicine 359 (10): 1027–36. doi:10.1056/NEJMcp0803977.


Kép


2014. február 11.

Szakács Dávid


Kapcsolódó cikkeink:

Evolúciós módszerek a fehérjék kölcsönhatásainak vizsgálatában 1. rész,

Evolúciós módszerek a fehérjék kölcsönhatásainak vizsgálatában 2. rész – A fág bemutatás
,

Evolúciós módszerek a fehérjék kölcsönhatásainak vizsgálatában 3. rész – A fág bemutatás alkalmazása szerin proteázok és kanonikus szerin proteáz inhibitorok kölcsönhatásának vizsgálatában



A szerzőről:

 

2011-ben végeztem az ELTE Biológus mesterszakán. Az ELTE Biológiai Doktori Iskola Szerkezeti biokémia programjának hallgatója vagyok. Munkám során az immunrendszer részét képező komplementrendszer valamint a véralvadásért felelős rendszer szerin proteáz enzimjeit hatékonyan és specifikusan gátló inhibitor molekulák fejlesztésén dolgozom a fág-bemutatás nevű irányított evolúciós módszerrel. Munkámat a TÁMOP 4.2.4.A/1-11-1-2012-0001 Nemzeti Kiválóság Program című kiemelt projektje támogatja. A projekt az Európai Unió támogatásával, az Európai Szociális Alap társfinanszírozásával valósul meg.


Cikk ajánlása » email:
Hozzászólás írása
Hozzászólás
 

Értékelések száma: 1, Cikk értéke (1-10):


Értékelje ezt a cikket! 


Hirdetés
Email cím:
Jelszó:

Regisztráció »
Elfelejtett jelszó »
Portálunk oldalai megfelelnek az egészségügyi információk megbízhatóságát és hitelességét garantáló HONcode előírásainak. Ezt: itt ellenőrizheti
Portálunk oldalai megfelelnek az egészségügyi információk megbízhatóságát és hitelességét garantáló HONcode előírásainak. Ezt:
itt ellenőrizheti
.
Oldal ajánlása (email):
Az ajánlót küldi (név):
Hirdetés