2017. szeptember 24. vasárnap
Gellért, Mercédesz
Biotechnológia, molekuláris biológia és élettan az mRNS.hu-n

Az info@mrns.hu-ra küldhet linket vagy valamilyen anyagot, amit szeretne, ha hírként bemutatnánk.


Korábbi híreink  |   Keresés:

Kiválasztott hír:
Megosztás: Add az iWiW-hez Add a Facebook-hoz Add a Twitter-hez Add a Google Reader-hez Add a Startlaphoz
Evolúciós módszerek a fehérjék kölcsönhatásainak vizsgálatában 3. rész – A fág bemutatás alkalmazása szerin proteázok és kanonikus szerin proteáz inhibitorok kölcsönhatásának vizsgálatában - 2014-02-11 11:54:37 Hozzászólás írása Hozzászólások száma 0 hozzászólás 
Evolúciós módszerek a fehérjék kölcsönhatásainak vizsgálatában 3. rész – A fág bemutatás alkalmazása szerin proteázok és kanonikus szerin proteáz inhibitorok kölcsönhatásának vizsgálatában

 
A sorozat első két részében (Evolúciós módszerek a fehérjék kölcsönhatásainak vizsgálatában   1. rész, Evolúciós módszerek a fehérjék kölcsönhatásainak vizsgálatában 2. rész – A fág bemutatás) bemutattam az irányított evolúciós megközelítést és annak legelterjedtebben alkalmazott eljárását, a fág bemutatást. Ebben a részben azt mutatom be, hogy egy konkrét interakció típus esetében milyen kérdések és feladatok merülhetnek fel, és ezek megoldásában hogyan van segítségünkre a fág bemutatás.
 

A proteázok más fehérjéket elhasítani képes létfontosságú enzimek. A proteázok egyfelől részt vesznek a fehérjék lebontásában, mint például a hasnyálmirigy által termelt proteázok az emésztés során, másfelől szabályozzák más fehérjék működését, mint például a vérszérumban működő proteázok. A proteázokról alkotott ismereteinket a MEROPS adatbázis gyűjti.

A proteázok legnépesebb csoportja a szerin proteázok, amelyek nevüket egy, az enzimek működése során kiemelt szerepű szerin aminosavról kapták. A szerin proteázok az élővilág összes nagy csoportjában megtalálhatók. Az emberi szervezetben is több tucat szerin proteáz működik. Létfontosságú folyamatokban töltenek be kulcsszerepet. Ilyen folyamatok például a táplálék fehérjéinek emésztése (kimotripszin, tripszin, elasztáz), a véralvadás (több véralvadási faktor), a vérrögök oldása (plazminogén aktivátor, plazmin), és bizonyos immunfolyamatok (a komplementrendszer enzimjei).

A szerin proteázok fehérje hasító képessége veszélyt is jelenthet a szervezetre nézve. Ezeknek az enzimeknek a hibásan szabályozott, elégtelen, vagy éppen túlzott aktivitása súlyos betegségek kialakulásához vezethet. A trombin szabályozatlan aktivitása vérrögképződést eredményez, melynek súlyos következményei az embólia, a szívinfarktus és az agyvérzés (stroke), amelyek a vezető halálokok között szerepelnek a fejlett országokban. Ezen keresztül belátható, hogy hatalmas jelentőséggel bír a szerin proteázok működésének megértése és specifikus gátlószerek fejlesztése olyan enzimekkel szemben, amelyek szabályozatlan aktivitása betegségek kialakulásához vezet.

A szerin proteázok működése a már említett okokból kifolyólag finomszabályozás alatt áll az élő rendszerekben. A szerin proteázok kordában tartásának a természetben gyakran előforduló módja a specifikus gátlószerekkel, úgynevezett inhibitor molekulákkal történő gátlás. Az inhibitorok a legtöbb esetben maguk is fehérjék.

 

1. ábra Különböző családokba tartozó kanonikus szerin proteáz inhibitorok térszerkezete. A minden kanonikus inhibitorra jellemző inhibitor hurkot sárgával kiemletem.


A kanonikus inhibitorok a szerin proteáz inhibitorok legváltozatosabb csoportja (MEROPS adatbázis). A kanonikus inhibitorok csoportjába 18 fehérje család tartozik, amelyek egymásnak evolúciós értelemben nem rokonai. A kanonikus inhibitorok legfontosabb közös jellemzője, hogy rendelkeznek egy minden képviselőjükben szinte azonos, azaz kanonikus térszerkezetű inhibitor hurokkal, innen származik a csoport elnevezése. Ezek az inhibitorok ezen a hurkon keresztül kötődnek az enzimnek ahhoz a felszínéhez, amivel az a hasítandó fehérjéket, azaz a szubsztrátokat is köti. Vagyis ezek az inhibitorok szubsztrátszerű módon kötődnek az enzimhez. Megfigyelhető az is, hogy a hatékony inhibitorok inhibitor hurok régiójának aminosav sorrendje általában hasonlít a gátolt enzim szubsztrátjainak aminosav sorrendjére.

Az inhibitorok az enzimmel stabil komplexet hoznak létre, így gátolják annak működését. Ez a működési mechanizmus látszólag ellentmondásos, hiszen az enzimeknek el kéne hasítaniuk ezeket az inhibitorokat. Ez az érdekesség az oka annak, hogy ez az egyik legtöbbet vizsgált fehérje-fehérje kölcsönhatás típus (Otlewski, Krowarsch, és Apostoluk 1999; Krowarsch és mtsai. 2003). A kutatókat régóta foglalkoztatja ugyanis, hogy mi teszi képessé a proteáz inhibitor fehérjéket a proteáz enzimek gátlására? Miért nem hasadnak el maguk is? Vagy ha elhasadnak, akkor mi különbözteti meg ezeket a többi fehérjétől?

 
2. ábra Különböző családokba tartozó kanonikus inhibitorok szerkezetét illesztettem egymásra. Az ábrán látható, hogy a különböző inhibitorok kanonikus inhibitor hurok régiójának térszerkezete nagyfokú hasonlóságot mutat, míg a molekulák többi része egymástól jelentősen eltér.
A felhasznált szerkezetek: ecotin, kék (PDB:1AZZ); Pacifastin, piros (PDB: 1GL1); Kazal, türkiz (PDB: 1TGS); Kunitz, zöld (PDB: 3FP6); Bowman-Birk, lila (PDB: 2G81); Textilinin, narancs (PDB: 3D65)


A több évtizedes kutatómunkának köszönhetően ma már rengeteg ismerettel rendelkezünk a szerin proteázok és kanonikus szerin proteáz inhibitorok kölcsönhatásairól. Azonban még mindig nem elegendő a tudásunk bizonyos összetett feladatok gyors megoldásához. A szerin proteázok jelentős része olyan környezetben működik, amiben rengeteg különböző szerin proteáz van jelen. Ilyen környezet például a vérszérum vagy a vékonybél. Ezek az enzimek gyakran nagyon hasonlítanak egymásra és egymással átfedő szerepeket töltenek be a rendszerben. Az egyes enzimek szerepének pontos feltárása során nagyon hasznos eszközök lehetnek olyan gátlószerek, amelyek célzottan csak egyetlen enzimet gátolnak, miközben a többi enzim működésére nincsenek hatással. Ilyen gátlószerek birtokában lehetőség nyílik az egyes enzimek funkcióinak felderítésére, illetve átfedő funkciók esetén annak kiderítésére, hogy melyik enzim milyen arányban járul hozzá az adott folyamathoz. Kézenfekvő megoldásként adódik, hogy a kanonikus inhibitorok között keressünk ilyen molekulákat. Azonban számos olyan enzim van, amelynek a természetből nem ismert kellőképpen hatékony és specifikus inhibitora. Ilyen esetekben a természetben előforduló inhibitorok klasszikus fehérjemérnöki módszerekkel történő fejlesztése rengeteg időt vehet igénybe, ugyanis egyszerre csak kevés pozícióban és kevés féle mutációt hordozó változat előállítására és tesztelésére van lehetőség. Ráadásul nem biztos, hogy a próbálkozásokat egyáltalán valaha siker koronázza. Éppen ilyen összetett feladatok megoldására fejlesztették ki az irányított evolúciós módszereket. A fág bemutatást számos esetben alkalmazták sikerrel olyan projektekben, amelyek az enzim-inhibitor kölcsönhatások finom részleteinek felderítését, vagy újfajta szerin proteáz inhibitorok kifejlesztését célozták (Zani és Moreau 2010).

A kanonikus szerin proteáz inhibitorok kicsi, stabil térszerkezetű, ellenálló fehérjék. Általában könnyen megjeleníthetőek a fonalas bakteriofágok felszínén. A kanonikus inhibitorok az inhibitor hurkon keresztül lépnek kölcsönhatásba az enzimmel. Ennek a huroknak a minden inhibitorban közös, központi része mindössze hat aminosav kiterjedésű. A sorozat első részében írtam, hogy az irányított evolúciós eljárások is csak bizonyos méretű könyvtárak áteresztésére képesek. A fág bemutatás esetében ez a határ néhány milliárd változatot jelent. Az újfajta inhibitorok kifejlesztését célzó kísérletekben leggyakrabban ezen a központi részen hoznak létre egy minden lehetséges variáns előfordulását lehetővé tevő könyvtárat. Ezen a részen feltétlenül meg kell találni az enzim gátlása szempontjából optimális megoldást. Hat vizsgált pozíció esetén ez 206, azaz 64 millió különböző fehérjét jelent. Ekkora változatosság még létrehozható úgy, hogy nagy valószínűséggel valóban jelen legyen az összes lehetséges változat a könyvtárban. Sok inhibitor az inhibitor hurok régión kívül más felszíneken keresztül is kapcsolatba kerül az enzimmel. Ezeknek a felszíneknek az evolválása is indokolt lehet. Sok esetben azonban a hurok régió fejlesztése is elegendőnek bizonyul.

Jó példa a kimotripszin C nevű enzim nagyfokú specifikusságának feltárása. A kimotripszin C a hasnyálmirigyben termelődik és a vékonybélbe ürül az emésztőenzimekhez hasonlóan. Szerepe azonban nem elsősorban a táplálék fehérjéinek emésztése, hanem az egyik legnagyobb mennyiségben jelen levő emésztő enzim, a tripszin aktivitásának szabályozása. A kimotripszin C képes elhasítani a tripszin inaktív előalakját egy meghatározott helyen, ezzel elősegítve annak aktiválódását a vékonybél kezdeti szakaszában. A kimotripszin C ezen kívül hozzájárul a tripszin inaktiválásához is a vékonybél késői szakaszában (Nemoda és Sahin-Tóth 2006; Szmola és Sahin-Tóth 2007). Szerepe lehet a túl korán, még a hasnyálmirigyben aktiválódó tripszin inaktiválásában is. Erre utal az is, hogy kimutatták: a kimotipszin C enzim hiánya megnöveli a hasnyálmirigy gyulladás kialakulásának valószínűségét (Rosendahl et al. 2008).

A kimotripszin C rendkívül specifikusnak bizonyult. A hasnyálmirigy által termelt többi enzim nem hasítja a tripszint azokon a pontokon, ahol a kimotripszin C igen, azaz a tripszin aktivitás szabályozására csak a kimotripszin C képes. Ennek a nagyfokú specifikusságnak a szerkezeti hátterét derítettük fel fág bemutatás segítségével (Szabó és mtsai. 2011).

A kísérletekhez egy Pacifastin családba tartozó kis inhibitort, az SGPI-2-t (Schistocerca gregaria protease inhibitor 2) választottuk. A könyvtár az inhibitor hurok hat központi pozíciójában az összes lehetséges fehérje variánst tartalmazta. Az irányított evolúciós kísérlet sikeres volt. Sikerült azonosítani olyan fág klónokat, amelyek a kimotripszin C enzimhez erősen és specifikusan kötő változatokat mutatnak be. A vizsgált klónokból nyert információt ezután szekvencia logó formájában ábrázoltuk.
 

3. ábra A kimotripszin C kötésére képes inhibitor variánsok szekvencia mintázata


A logó az irányított evolúciós kísérletek eredményeinek rendkívül szemléletes bemutatását teszi lehetővé. A logón az aminosavak egybetűs kódjának használatával az van feltüntetve, hogy a kimotripszin C kötő fág klónok a vizsgált pozíciókban milyen aminosavakat hordoznak. Az egyes oszlopok magassága azt tükrözi, hogy az adott oszlopban az aminosavak előfordulási gyakorisága milyen messze van az egyenletestől. A legegyenetlenebb eloszlás az, amikor csak egyetlen aminosav fordul elő egy pozícióban. Ezeknek az oszlopoknak maximális a magassága. Ha egy pozícióban mind a 20 aminosav előfordul, ráadásul egyforma gyakorisággal, akkor tökéletesen egyenletes az eloszlás. Ebben az esetben az adott pozícióban az oszlop magassága nulla lenne. A magasabb oszlopokban tehát kevesebb féle aminosav fordul elő a megvizsgált klónokban, azaz itt komoly feltétele van a kimotripszin C-hez való kötésnek. Az egyes betűk magassága egy pozícióban az aminosavak előfordulási gyakoriságával arányos. A betűk színe az aminosavak kémiai karakterére utal, a hasonló karakterű aminosavak azonos színnel vannak feltüntetve.

A kimotripszin C ismert hasítóhelyeinek vizsgálatából már korábban látszott, hogy az úgynevezett vesszős pozíciókban (lásd 3. ábra) a hasítóhelyek többségében savas karakterű aminosavak is előfordulnak. Az evolúciós kísérleteink is hasonló eredménnyel jártak, azaz megjelentek a savas karakterű aminosavak (D, E) a P2’ és P4’ pozíciókban. Több inhibitor változatot előállítottunk a megismert szekvencia mintázat alapján, és teszteltük, hogy ezek milyen erősen kötődnek a kimotripszin C-hez, illetve más, a hasnyálmirigy által termelt enzimekhez. Azt tapasztaltuk, hogy a negatív töltésű oldalláncok jelenléte a P2’ és P4’ pozíciókban jelentősen hozzájárul a specifikussághoz. Ez azt jelenti, hogy a negatív oldalláncokkal rendelkező inhibitorok hasonló vagy kicsit nagyobb hatékonysággal gátolnak kimotripszin C-t, mint a töltés(eke)t nélkülöző változatok, miközben a többi hasnyálmirigy enzim számára szinte elfogadhatatlanok kölcsönható partnerként. Azaz a kimotripszin C által felismert és elhasított fehérje részletek vesszős pozícióiban előforduló negatív töltéseknek nagy szerepe van abban, hogy csakis a kimotripszin C képes ezeken a helyeken hasítani a tripszint, és ezáltal szabályozni annak aktivitását. Ezt támasztja alá az is, hogy sikerült azonosítani a kimotripszin C felszínén három pozitívan töltött aminosavat, amelyek kedvező kölcsönhatásokat alakítanak ki az inhibitor negatívan töltött oldalláncaival.

A fág bemutatás segítségével tehát sikerült feltárnunk a kimotripszin C enzim hatékony gátlását lehetővé tevő szekvencia mintázatot. Ez alapján elő tudtunk állítani olyan inhibitor változatokat, amelyek vizsgálatával szerkezeti magyarázatot találtunk a kimotripszin C nagyfokú specifikusságára.

Forrás:

Krowarsch, D, T Cierpicki, F Jelen, és J Otlewski. 2003. „Canonical protein inhibitors of serine proteases”. Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS 60 (11): 2427–2444. doi:10.1007/s00018-003-3120-x.
Nemoda, Zsófia, és Miklós Sahin-Tóth. 2006. „Chymotrypsin C (Caldecrin) Stimulates Autoactivation of Human Cationic Trypsinogen”. Journal of Biological Chemistry 281 (17): 11879–11886. doi:10.1074/jbc.M600124200.
Otlewski, J, D Krowarsch, és W Apostoluk. 1999. „Protein inhibitors of serine proteinases”. Acta Biochimica Polonica 46 (3): 531–565.
Rosendahl, Jonas, Heiko Witt, Richárd Szmola, Eesh Bhatia, Béla Ozsvári, Olfert Landt, Hans-Ulrich Schulz, et al. 2008. „Chymotrypsin C (CTRC) Variants That Diminish Activity or Secretion Are Associated with Chronic Pancreatitis”. Nature Genetics 40 (1): 78–82. doi:10.1038/ng.2007.44.
Szabó, András, Dávid Héja, Dávid Szakács, Katalin Zboray, Katalin A Kékesi, Evette S Radisky, Miklós Sahin-Tóth, és Gábor Pál. 2011. „High Affinity Small Protein Inhibitors of Human Chymotrypsin C (CTRC) Selected by Phage Display Reveal Unusual Preference for P4’ Acidic Residues”. The Journal of Biological Chemistry 286 (25): 22535–22545. doi:10.1074/jbc.M111.235754.
Szmola, Richárd, és Miklós Sahin-Tóth. 2007. „Chymotrypsin C (caldecrin) Promotes Degradation of Human Cationic Trypsin: Identity with Rinderknecht’s Enzyme Y”. Proceedings of the National Academy of Sciences 104 (27): 11227–11232. doi:10.1073/pnas.0703714104.
Zani, Marie-Louise, és Thierry Moreau. 2010. „Phage display as a powerful tool to engineer protease inhibitors”. Biochimie 92 (11): 1689–1704. doi:10.1016/j.biochi.2010.05.003.


Kép: M13 fág burok részletének modellje a rajta bemutatott/megjelenített Pacifastin inhibitorral és  SGPI-2 – p8 vektor.

2014. január. 23.

Szakács Dávid


Kapcsolódó cikkeink:
Evolúciós módszerek a fehérjék kölcsönhatásainak vizsgálatában 1. rész
Evolúciós módszerek a fehérjék kölcsönhatásainak vizsgálatában 2. rész – A fág bemutatás


A szerzőről:



 
2011-ben végeztem az ELTE Biológus mesterszakán. Az ELTE Biológiai Doktori Iskola Szerkezeti biokémia programjának hallgatója vagyok. Munkám során az immunrendszer részét képező komplementrendszer valamint a véralvadásért felelős rendszer szerin proteáz enzimjeit hatékonyan és specifikusan gátló inhibitor molekulák fejlesztésén dolgozom a fág-bemutatás nevű irányított evolúciós módszerrel. Munkámat a TÁMOP 4.2.4.A/1-11-1-2012-0001 Nemzeti Kiválóság Program című kiemelt projektje támogatja. A projekt az Európai Unió támogatásával, az Európai Szociális Alap társfinanszírozásával valósul meg.


Cikk ajánlása » email:
Hozzászólás írása
Hozzászólás
 

Értékelések száma: 3, Cikk értéke (1-10):


Értékelje ezt a cikket! 


Hirdetés
Email cím:
Jelszó:

Regisztráció »
Elfelejtett jelszó »
Portálunk oldalai megfelelnek az egészségügyi információk megbízhatóságát és hitelességét garantáló HONcode előírásainak. Ezt: itt ellenőrizheti
Portálunk oldalai megfelelnek az egészségügyi információk megbízhatóságát és hitelességét garantáló HONcode előírásainak. Ezt:
itt ellenőrizheti
.
Oldal ajánlása (email):
Az ajánlót küldi (név):
Hirdetés