2017. november 23. csütörtök
Kelemen, Klementina
Biotechnológia, molekuláris biológia és élettan az mRNS.hu-n

Az info@mrns.hu-ra küldhet linket vagy valamilyen anyagot, amit szeretne, ha hírként bemutatnánk.


Korábbi híreink  |   Keresés:

Kiválasztott hír:
Megosztás: Add az iWiW-hez Add a Facebook-hoz Add a Twitter-hez Add a Google Reader-hez Add a Startlaphoz
Evolúciós módszerek a fehérjék kölcsönhatásainak vizsgálatában 2. rész – A fág bemutatás - 2014-01-23 08:57:15 Hozzászólás írása Hozzászólások száma 1 hozzászólás 
Evolúciós módszerek a fehérjék kölcsönhatásainak vizsgálatában 2. rész – A fág bemutatás

A fehérjéknek minden életfolyamatban kiemelt szerepük van. A fehérjék feladatukat általában más fehérjékkel és nem fehérje típusú molekulákkal kialakított kölcsönhatásaikon keresztül látják el. Ezért fontos ezeknek a kölcsönhatásoknak a lehető legteljesebb megismerése, akár atomi részletességű feltárása. Ezek a kölcsönhatások gyakran nagy kötőfelszíneken keresztül jönnek létre. A kötőfelszínek kialakításában akár több tucat aminosav is részt vehet. Ezért klasszikus fehérjemérnöki megközelítéssel hatalmas munkát jelent egy bizonyos kötőfelszínt kialakító egyes aminosavak egyedi szerepének, fontosságának vizsgálata, vagy például az aminosav oldalláncok közti energetikai kapcsolatok feltérképezése.

Ilyen kérdések megválaszolására és újfajta kölcsönható partnerek fejlesztésére alkalmasak az irányított evolúciós megközelítést alkalmazó módszerek. Az irányított evolúciós megközelítésről írtam általánosságban a sorozat első részében. Ebben a részben ismertetem a legkorábban kifejlesztett, mindmáig leggyakrabban és legsikeresebben alkalmazott irányított evolúciós megközelítést alkalmazó módszert, a fág bemutatást. A cikk itt érhető el: http://www.mrns.hu/hirek/evolucios-modszerek-a-feherjek-kolcsonhatasainak-vizsgalataban-1-resz

A bakteriofágok baktérium sejteken élősködő vírusok. Számos típusuk ismert, ezek közül több is alkalmas fág bemutatásra. Ebben az írásban csak a legelterjedtebben alkalmazott, ún. fonalas bakteriofágokat használó módszerről írok. A fonalas bakteriofágok rendkívül egyszerű szervezetek. A vírus 1-2µm hosszú, 6,5nm átmérőjű fehérje burkát ötféle fehérje (p3, p6, p7, p8, p9) építi fel. Az 1. ábrán is látható, hogy a hosszú, fonálszerű fehérje burok testét a p8 fehérje több ezer példánya alkotja. A burok egyik végét a p3 és p6 fehérjék 5-5 példánya zárja le. A másik végén a p7 és p9 fehérjék szintén 5-5 példánya található. A vírus részecskében a genom egy egyszálú cirkuláris DNS molekula formájában van jelen, és mindössze 10 fehérje kódoló gént tartalmaz. A fonalas bakteriofágok ún. nem-lítikus fágok, azaz nem pusztítják el a megfertőzött sejteket. A fonalas bakteriofágok csak ún. konjugatív F-pilussal rendelkező Gram- baktériumokat képesek megfertőzni. A legtöbb elterjedten használt laboratóriumi baktérium törzs nem rendelkezik F-pilussal. Ezért a fonalas fágokkal való munka biztonságos: még egy sok kutatócsoportot foglalkoztató intézetben sem kell tömeges fág fertőzéstől tartani.


 
1.ábra A fonalas bakteriofágok elektronmikroszkópos képe (fent) és felépítésük sematikus ábrázolása (lent).
Az ábrát Dr. Pál Gábor készítette


A fertőzés során a vírus egyszálú DNS-e bejut a baktérium sejtbe, majd a sejt fehérjéi és enzimei által kétszálú, replikatív DNS-sé alakul. A kétszálú formáról a baktérium sejt fehérje expressziós rendszere által termelődni kezdenek a vírus fehérjéi. A vírus fehérjéi közül kettő, a p2 és a p10) szükséges az ún.gördülő kör („rolling-circle”) mechanizmus szerint történő replikációhoz. Ez a folyamat nagyszámban állítja elő a később vírus burokba pakolódó egyszálú DNS-t.A vírus DNS gördülő kör mechanizmussal történő másolása elindul, amint a p2 és p10 fehérjék mennyisége meghalad egy küszöb értéket. A termelődő p5 vírus fehérje a keletkező egyszálú DNS-hez köt, és szinte teljesen bevonja azt. Ezt követően a baktérium sejt belső membránjának belső felszínén a p5 fehérje p8-ra cserélődik, a vírus két végére beépül a p3 és p6, illetve a p7 és p9 fehérjék 5-5 példánya. A fág egy szűk csatornán keresztül elhagyja a sejtet. A folyamatban számos bakteriális fehérje is részt vesz (Marvin 1998).
 



2. ábra A fonalas bakteriofágok életciklusa.  George P. Smith rajza (Smith GP. Filamentous phage as cloning vectors. In: Rodriguez RL ed: Vectors: A Survey of Molecula Cloning Vectors and Their Uses. Boston: Butterworth, 1987:61-83.)  - Dr. Pál Gábor kiegészítéseivel


A fág bemutatás rendszerekben a vizsgálni kívánt fehérje génjét a bakteriofág valamely burokfehérjéje génjéhez illesztik, így egy ún. fúziós gént létrehozva. A leggyakrabban a p3, a p6 vagy a p8 fehérjét használják. A fúziós génről fúziós fehérje termelődik, ami egy megfelelő hosszúságú polipeptid linkeren keresztül összekötve tartalmazza a burokfehérjét és a vizsgálni kívánt fehérjét. A fúziós fehérje a burokfehérjén keresztül be tud épülni a fág fehérje burkába úgy, hogy a vizsgálni kívánt fehérje a partner számra hozzáférhetően megjelenik a burok felszínén, azaz bemutatásra kerül. Ebben a rendszerben a vizsgált fehérje (fenotípus) és az azt kódoló gén (genotípus) fizikai kapcsolata a vírus fehérje burkán keresztül valósul meg.


 
3. ábra A felszínén idegen fehérjét bemutató bakteriofág sematikus ábrázolása. A vírus genomjában megtalálható a fúziós gén, ami a burokfehérjével (fekete) egy polipeptid linkeren keresztül összekötött idegen fehérjét (piros) kódolja. A fúziós fehérje a burokfehérje révén be tud épülni a fehérje burokba. A fúziós fehérjét kódoló gén és a fehérje között fizikai kapcsolat van.


A fág-bemutatás első leírása George P. Smith nevéhez fűződik(G. P. Smith 1985). Smith ap3 fehérje génjébe illesztett idegen fehérjét kódolóDNS szekvenciát és bizonyította, hogy az inzertaz eredeti fehérjére specifikus ellenanyagok számára hozzáférhető módon megjelenik a vírus felszínén. Kimutatta azt is, hogy a fág megőrzi a fertőzőképességét. Ehhez a fúziós fághoz nagymennyiségű vadtípusú fágot kevert, és demonstrálta, hogy a fúziós fág aránya a kiindulási arány több mint 1000-szeresére növelhető: az idegen fehérjét felismerő ellenanyag segítségével képes kiválogatni a keverékből a fúziós fágokat. Innen már csak egy lépés az irányított evolúció. Az idegen fehérje génjén mutációkat végezve könyvtárat kapunk, amiből az idegen fehérje kötőpartnerének segítségével kiválogathatók a kötés képességével rendelkező változatok. Egy évtized alatt a fág bemutatás technikák sorát fejlesztették ki, amelyek számos esetben bizonyítottak bonyolult kérdések megválaszolása során (G. P. Smith és V. Petrenko 1997).
 



4. ábra A fág bemutatás sémája


Az irányított evolúciós vizsgálatok esetében gyakori kérdés, hogy egy fehérje adott pozícióiban milyen aminosavak jelenléte teszi lehetővé, hogy a fehérje egy másik molekulához kössön. Az irányított evolúciós könyvtárat a fúziós gén felhasználásával készítik el. Valamilyen mutagenezis technikával hatalmas változatosságot generálnak a bemutatott fehérje vizsgálatba vont pozícióiban. Ezek leggyakrabban a kölcsönható felszínt kialakító pozíciók. Az előállított egyedi variánsok száma elérheti akár a néhány milliárdot is. Ezt követően a létrejött könyvtár tagokat baktérium sejtekbe juttatják szigorúan ügyelve arra, hogy egyetlen sejtbe csak egyetlen könyvtártag juthasson be. Ez nélkülözhetetlen ahhoz, hogy megmaradjon a szigorú, egyértelmű kapcsolat a genotípusok és a fenotípusok között, azaz minden vírus felszínén csak egyféle fehérje variáns jelenhet meg, és a vírusnak tartalmaznia kell ennek génjét is. Ha egyetlen sejtbe több könyvtártag is bejutna, akkor a termelődő fágok felszínén többféle fehérje, azaz többféle fenotípus is megjelenhetne. Ugyanakkor minden egyes fág csak az egyik változat génjét fogja tartalmazni. Ez hatalmas problémát okozna az eredmények kiértékelésekor, mint azt később látni fogjuk.

A könyvtártagokat hordozó baktériumok rengeteg vírust termelnek, amelyek mindegyike a felszínén hordozza a vizsgált fehérje egy változatát. Ebből a sokaságból kiválogatják azokat a változatokat, amelyek képesek kötni a partner molekulához. Ennek során a kötőpartnert rögzítik egy felszínen, majd a fágokat oldatban rámérik erre a felszínre. Meghatározott idő után a nem-kötő változatokat mosással eltávolítják, majd a felszínen maradt vírusokat legyűjtik olyan módon, hogy azok megőrizzék a fertőzőképességüket. Ezt követően a szelekciós feltételeket teljesítő vírusokkal baktérium sejteket fertőznek, amelyek felszaporítják a kötőképes változatokat. Ezt a ciklust néhányszor megismételve olyan alkönyvtár jön létre, ami nagy arányban tartalmaz a partnerhez kötni képes változatokat.

Az eredmények kiértékelésének első lépéseként a szelekciót teljesítő változatokat tartalmazó alkönyvtárból egyedi fág klónokat izolálnak. Minden klón csak egyféle fehérje változat génjét tartalmazza, és ez a változat megjelenik a klónhoz tartozó fágok felszínén. Külön csövekben fágokat termeltetnek baktérium sejtekkel, így minden vizsgáltba vont változat nagy mennyiségben áll rendelkezésre. Minden kiválasztott klón esetében egyesével igazolják a partnerhez való kötés képességét. Ez egy egyszerű, egy nap alatt elvégezhető teszt, amiben egyszerre több száz klón megvizsgálható. Alapvetően a szelekciós eljáráshoz hasonlít a folyamat, azaz a felszínhez rögzített kötőpartnerre rámérik a klonális fágokat oldatban, majd meghatározott idő elteltével az oldatban maradt fágokat mosással eltávolítják. Ezután a fágot felismerő jelölt ellenanyag segítségével kimutatható, hogy a fágon bemutatott fehérje variáns kötődött-e az interakciós partnerhez, azaz maradtak-e a mosást követően fágok a mintahely felszínén. A kísérlet jellegétől függően néhány tíz, de akár több száz klón vizsgálata szükséges.
 


5. ábra A megvizsgált klónok színreakciót adnak, ha az általuk bemutatott fehérje változat kötődik a partner molekulához. Ha a kötés nem specifikus a partnerre, akkor olyan mintahelyen is kaphatunk jelet, amin nincs is jelen a kísérletek során alkalmazott kötő partner (lásd a bekeretezett mintahelyek). Ezeket a klónokat a későbbi elemzésekből természetesen kihagyják.


Az eredmények kiértékelésének következő lépése az igazoltan kötőképes klónok által hordozott gének bázis sorrendjének meghatározása, azaz a DNS szekvenálása. A DNS bázissorrendje egyértelműen meghatározza a fehérje aminosav sorrendjét, azaz a DNS szekvenálásán keresztül megismerjük a fehérje szekvenciáját is. Ez ma már rutin eljárás. Itt hangsúlyozom ismét, hogy mennyire fontos annak biztosítása, hogy a folyamat során végig megmaradjon a genotípus és fenotípus egyértelmű, fizikai kapcsolata. A változatok közül a bemutatott fehérje tulajdonságai, vagyis a fenotípus alapján kerülnek kiválasztásra azok, amelyek teljesítik a szelekció során támasztott feltételeket. Az információ feldolgozása során viszont a genotípust vizsgáljuk. Ha vannak a rendszerben olyan klónok, amelyek esetében sérült a genotípus és fenotípus közti egyértelmű viszony, az információ vesztéssel járhat. Legrosszabb esetben akár hamis információ is bekerülhet az eredmények közé, ami rontja az adatok minőségét. A genotípus és fenotípus közti kapcsolat biztosítása tehát kritikusan fontos annak érdekében, hogy a kapott eredmények valóban a valóságot tükrözzék.

Az eredmények tehát DNS szekvenciák, illetve a DNS szekvenciákból fordított fehérje szekvenciák formájában kaphatók meg. Az eredmények feldolgozásának utolsó lépései során megvizsgálják, hogy az evolvált pozíciókban mely aminosavak és milyen gyakoriságban fordulnak elő. Ez alapján számos fontos kérdésre kapható válasz. A fág bemutatás sokféle kölcsönhatás típus vizsgálatára alkalmas. Segítségével részletekbe menően felderíthető nagy kötőfelszínek esetében az egyes aminosavak hozzájárulása a kölcsönhatáshoz (Pal, Kossiakoff, és Sidhu 2003), valamint az is, hogy mely pozíciókban és pontosan milyen mutációval lehet az eredetinél erősebben kötő partnert létrehozni (Pál et al. 2006).

A fág bemutatás részletekbe menő leírása megtalálható Sidhu és munkatársai munkájában (Sidhu et al. 2000).

Laboratóriumunkban elsősorban más fehérjéket elhasítani képes szerin proteáz enzimek és ezek úgynevezett kanonikus inhibitorainak kölcsönhatásait vizsgáljuk. Az inhibitor molekulák maguk is fehérjék, így a kölcsönhatások vizsgálatára remek megoldást kínál a fág bemutatás lehetősége. Kutatásaink során újfajta inhibitorokat is fejlesztünk olyan enzimekkel szemben, amelyeknek a természetből nem ismert specifikus és hatékony gátlószere. A fág bemutatás ezekre a feladatokra is ideális technika. A sorozat következő részében bemutatom a fág bemutatás használatát a szerin proteáz inhibitorok vizsgálatát és fejlesztését célzó projektekben.


Források:

Marvin, D A. 1998. „Filamentous Phage Structure, Infection and Assembly”. Current Opinion in Structural Biology 8 (2): 150–158.

Pal, Gabor, Anthony A Kossiakoff, és Sachdev S Sidhu. 2003. „The Functional Binding Epitope of a High Affinity Variant of Human Growth Hormone Mapped by Shotgun Alanine-Scanning Mutagenesis: Insights into the Mechanisms Responsible for Improved Affinity”. Journal of Molecular Biology 332 (1): 195–204.

Pál, Gábor, Jean-Louis K Kouadio, Dean R Artis, Anthony A Kossiakoff, és Sachdev S Sidhu. 2006. „Comprehensive and Quantitative Mapping of Energy Landscapes for Protein-Protein Interactions by Rapid Combinatorial Scanning”. The Journal of Biological Chemistry 281 (31): 22378–22385. doi:10.1074/jbc.M603826200.

Sidhu, S S, H B Lowman, B C Cunningham, és J A Wells. 2000. „Phage Display for Selection of Novel Binding Peptides”. Methods in Enzymology 328: 333–363.

Smith, G P. 1985. „Filamentous Fusion Phage: Novel Expression Vectors That Display Cloned Antigens on the Virion Surface”. Science (New York, N.Y.) 228 (4705): 1315–1317.

Smith, George P., és Valery A. Petrenko. 1997. „Phage Display”. Chemical Reviews 97 (2): 391–410.

Kép


2014. január. 14.

Szakács Dávid



Kapcsolódó cikkünk:

Evolúciós módszerek a fehérjék kölcsönhatásainak vizsgálatában 1. rész


Evolúciós módszerek a fehérjék kölcsönhatásainak vizsgálatában 3. rész – A fág bemutatás alkalmazása szerin proteázok és kanonikus szerin proteáz inhibitorok kölcsönhatásának vizsgálatában


A szerzőről:



2011-ben végeztem az ELTE Biológus mesterszakán. Az ELTE Biológiai Doktori Iskola Szerkezeti biokémia programjának hallgatója vagyok. Munkám során az immunrendszer részét képező komplementrendszer valamint a véralvadásért felelős rendszer szerin proteáz enzimjeit hatékonyan és specifikusan gátló inhibitor molekulák fejlesztésén dolgozom a fág-bemutatás nevű irányított evolúciós módszerrel. Munkámat a TÁMOP 4.2.4.A/1-11-1-2012-0001 Nemzeti Kiválóság Program című kiemelt projektje támogatja. A projekt az Európai Unió támogatásával, az Európai Szociális Alap társfinanszírozásával valósul meg.
Cikk ajánlása » email:
Hozzászólás írása
Hozzászólás
 

Értékelések száma: 8, Cikk értéke (1-10):


Értékelje ezt a cikket! 

Küldő: inf3rno2014-02-10 10:17:47 
Próbálkoztatok már a kísérletek automatizálásával? Ahogy nézem a megfelelő robotikai és informatikai eszközökkel ezek a kísérletek teljes mértékben automatizálhatóak... (Mondjuk ez a legtöbb kísérletről, amit jelenleg kézzel végeznek ugyanígy elmondható.)
 

Hirdetés
Email cím:
Jelszó:

Regisztráció »
Elfelejtett jelszó »
Portálunk oldalai megfelelnek az egészségügyi információk megbízhatóságát és hitelességét garantáló HONcode előírásainak. Ezt: itt ellenőrizheti
Portálunk oldalai megfelelnek az egészségügyi információk megbízhatóságát és hitelességét garantáló HONcode előírásainak. Ezt:
itt ellenőrizheti
.
Oldal ajánlása (email):
Az ajánlót küldi (név):
Hirdetés