2017. szeptember 22. péntek
Móric, Ottó
Biotechnológia, molekuláris biológia és élettan az mRNS.hu-n

Az info@mrns.hu-ra küldhet linket vagy valamilyen anyagot, amit szeretne, ha hírként bemutatnánk.


Korábbi híreink  |   Keresés:

Kiválasztott hír:
Megosztás: Add az iWiW-hez Add a Facebook-hoz Add a Twitter-hez Add a Google Reader-hez Add a Startlaphoz
Evolúciós módszerek a fehérjék kölcsönhatásainak vizsgálatában 1. rész - 2014-01-23 08:56:42 Hozzászólás írása Hozzászólások száma 1 hozzászólás 
Evolúciós módszerek a fehérjék kölcsönhatásainak vizsgálatában   1. rész

Bevezetés

Az élő szervezetben lejátszódó megszámlálhatatlan kémiai folyamatot katalizáló enzimek, a gének kifejeződését szabályozó transzkripciós faktorok, a szervezet működésének szabályozásában fontos szerepet betöltő sejtfelszíni receptorok és a hormonok nagy része mind fehérje természetű anyagok. Amióta nyilvánvalóvá vált, hogy a fehérjék a biológiai folyamatok mindegyikében döntő szerepet játszanak, a fehérjék és kölcsönhatásaik vizsgálata a biológia kiemelten fontos területe lett.

A legtöbb biológiai kísérlet alapja, hogy a vizsgált rendszer megváltoztatásának, megzavarásának következményei alapján vonnak le a kutatók következtetéseket az eredeti rendszer működésével kapcsolatosan. A molekuláris biológiai módszerek fejlődése lehetővé tette a gének klónozását és az irányított mutagenezist, azaz a gének által kódolt fehérjék egyes aminosavainak célzott lecserélését. Ennek köszönhetően ma már a fehérjék aminosav sorrendje szabadon változtatható. Mutagenezisen alapuló módszerek egész sorát fejlesztették ki a kutatók. Az ilyen kísérletek során a fehérje egy, vagy néhány pozíciójában megváltoztatják az eredeti aminosavat, majd ezeknek a mutáns fehérjéknek a tulajdonságait hasonlítják össze a természetben is előforduló, úgynevezett vadtípusú fehérjével. A mutációk szerkezetre és funkcióra gyakorolt hatásán keresztül igyekeznek az eredeti aminosavak szerepét feltárni. A sok mutáns egyenkénti előállítása, tisztítása és vizsgálata igen idő- és költségigényes, ráadásul a vizsgálatok eredményei alapján felmerülő újabb kérdéseket megválaszolni, a hipotéziseket alátámasztani csak egy, de általában több újabb mutáns előállításával és részletes vizsgálatával lehetséges.

Azonban hamar kiderült, hogy a lehetséges változatok igen nagy száma miatt az összes variánst nem lehet előállítani. Egy fehérje minden aminosavpozícióját érintő teljes feltérképezésének már gyakorlati akadályai vannak egyedi mutánsok vizsgálata esetén is. Mutációk különböző kombinációinak vizsgálata esetén a lehetséges variánsok száma még nagyobb. Az áttörést az irányított evolúciós módszerek megjelenése jelentette, melyek olyan esetekben alkalmazhatók, amikor a vizsgálat tárgya valamely adott molekulához szelektíven kötődő fehérje.


Az irányított evolúciós módszerekről

A természetes evolúció elméletét Charles Darwin (1.kép) dolgozta ki azóta is elfogadott formában 1859-ben megjelentett A fajok eredete című művében. Az evolúció elméletének eszenciája néhány mondatban, illetve egyetlen egyszerű ábrán összefoglalható és megmagyarázza a földi élet sokszínűségének kialakulását a leszármazás, öröklődés, új változatok megjelenése és a változatok közötti természetes szelekció segítségével.

Evolúciós folyamatok működésbe lépésének mindössze néhány alapvető feltétele van: a szaporodás képessége, az öröklődés (az utód hasonlít a szülő(k)re) és a változatosság (az utód nem tökéletes másolata a szülő(k)nek). Azon rendszerben, melyben a feltételek teljesülnek, evolúciós folyamatok indulnak be abban az esetben, ha a tagok tulajdonságai befolyásolják azok szaporodási sikerét, azaz a rátermettséget. Egy ilyen rendszerben az adott környezeti feltételek között legjobban teljesítők szaporodnak a legnagyobb mértékben, utódaik aránya a következő generációban nagyobb lesz.

 

1, ábra. Egy rendszerben evolúciós folyamatok lépnek működésbe, ha a rendszerben lévő egyedek szaporodásra képesek, a szaporodás során a szülő(k) tulajdonságait az utódok öröklik, de az utódok nem tökéletes másolatai a szülőknek, azaz újabb változatok jelenhetnek meg. Ha a különböző változatok szaporodási sikere, vagyis rátermettsége különbözik, akkor a rátermettebb egyedek utódainak aránya a következő generációban nagyobb lesz (lásd A egyed utódai).


 
Olyan esetekben, amikor a vizsgálat tárgya más molekulához szelektíven kötődő fehérje, alkalmazhatóak azok a megközelítések, amelyek a bevezetésben említett problémákat mintegy kikerülik, a természetes evolúciós folyamatokat utánozzák és amelyeket irányított evolúciós eljárásoknak is nevezhetünk. Ezek a fehérje nagyszámú különböző mutánsának (variánsok könyvtára) előállításán és az így létrehozott sokaságból a szelektív kötésen alapuló szelekción nyugszanak. A legkorábban kifejlesztett és máig a legszélesebb körben alkalmazott irányított evolúciós eljárást a fág-bemutatást George P. Smith (1.kép) fejlesztette ki az 1980-as évek második felében (Smith és Petrenko, 1997).
 



1. kép. Charles Darwin (bal oldalt), a természetes evolúció elméletének és George P. Smith (jobb oldalt), az irányított evolúciós megközelítés első változatának, a fág-bemutatásnak kidolgozója.


A megközelítés minden olyan fehérje vizsgálatára alkalmas, ami valamilyen más molekulához specifikusan kötődni képes: enzim-szubsztrát, receptor-ligandum, antigén-antitest kapcsolatok feltárására is van így lehetőség, vizsgálhatók a molekuláris felismerés folyamatai és törvényszerűségei. Az irányított evolúciós technikák gyors fejlődését előmozdította az is, hogy segítségükkel nem csak vizsgálni lehet a fehérjéket, de akár „fejleszteni” is. Az ipar és a gyógyászat egyre több fehérjét használ, az új fehérjék felfedezésének fontossága magával hozta a fehérjemérnöki technológiák teljesen új ágainak megjelenését, melyek például új enzimek kifejlesztésére alkalmasak meglévő fehérjék módosításával (Minshull és Stemmer, 1999; Sidhu és Koide, 2007).

Az irányított evolúciós technikák (2.ábra) nagy előnye, hogy a mutánsokat nem kell egyenként előállítani, tisztítani és vizsgálni. A könyvtárat különböző, PCR-en és/vagy degenerált szintetikus oligonukleotidok használatán alapuló módszerek segítségével, DNS formában állítják elő egy reakcióban. A létrehozott DNS könyvtárat ezután olyan módon „fordítják” át fehérjékké hogy a fehérjék a génjeikkel fizikai kapcsolatban maradnak. A fehérje könyvtárból ezt követően a fehérje specifikus kötőpartnerének segítségével kiválogatják azokat a változatokat, amelyek a mutációk ellenére megőrizték a partner kötésének képességét, vagy éppen a mutációknak köszönhetően erősebben kötik azt. A fehérjék és génjeik fizikai kapcsolatát kihasználva egyedi mutánsok vizsgálata helyett az adott funkcióra szelektált változatok génjeinek szekvencia-analízisével deríthető ki, hogy milyen aminosav sorrendek alkalmasak a funkció ellátására. A könyvtárkészítés és a szelekció során tulajdonképpen egy térben zajlik akár sok millió egyedi kísérlet, melyeket egyenként képtelenség volna elvégezni. Így lehetőség van sokkal több mutáns megvizsgálására, mint egyedi változatok előállítása esetén.

 
2. ábra. Az irányított evolúciós kísérletek sémája



Az irányított evolúciós módszereknek számos változatát fejlesztették ki az elmúlt bő két évtizedben a kutatók. A könyvtár készítése során előidézett mutációk lehetnek véletlenszerűek, de van lehetőség arra is, hogy csak a meghatározott pozíciókban és csak bizonyos aminosavak jelenhessenek meg. A könyvtár fehérje formában való kifejezésére szintén számos lehetőség van. A különböző könyvtárkészítési és szelekciós módszerek egymástól nem függetlenek. A vizsgálni kívánt interakció és a kiválasztott szelekciós eljárás meghatározza, hogy hány variánst tartalmazó könyvtárat kell előállítani, valamint azt, hogy erre melyik könyvtárkészítési módszer a leginkább megfelelő. A módszerek sokféleségének köszönhetően maga az irányított evolúciós megközelítés rendkívül rugalmasan alkalmazható sokféle kérdés megválaszolására (Diaz et al., 2003).

Az irányított evolúciós módszereknek is vannak azonban korlátai. A szelekciós eljárások csak bizonyos varianciájú könyvtárak áteresztésére képesek, nagyobb könyvtár esetén könnyen elveszhetnének olyan változatok is, melyek teljesítenék a szelekciós feltételeket. Olyan könyvtár létrehozásának, ami egy adott hosszúságú polipeptid összes lehetséges variánsát tartalmazza, már elvi akadályai is vannak a lehetséges variánsok számának exponenciális növekedése miatt. Egy 60 aminosavból álló polipeptid esetében a lehetséges variánsok száma 2060, ami meghaladja az univerzumban létező elemi részecskék számát. Ezért e módszerek alkalmazásakor sincs lehetőség a fehérje összes aminosav pozíciójának teljeskörű vizsgálatára. Vagy az egyes pozíciókban előforduló variációk számát, vagy a vizsgált pozíciók számát korlátok közé kell szorítani. A módszerek alkalmazhatóságát korlátozza az is, hogy segítségükkel csak más molekulához szelektíven kötő fehérjék vizsgálhatók, melyeknek a kötőpartnere is ismert.

Összefoglalásként elmondható, hogy egy jól megtervezett és kivitelezett irányított evolúciós kísérlet sorozat eredményeként kapott információ mennyisége és minősége alkalmas lehet arra, hogy olyan új, hasznos tulajdonságú peptideket és fehérje variánsokat fejlesszenek ki, amelyek a természetben nem fordulnak elő. Ilyenek például egyes enzim inhibitorok, vagy az egyre inkább elterjedőben lévő terápiás monoklonális ellenanyagok, mint a Humira nevű szer. A Humira a rheumatoid arthritis és néhány más autoimmun betegség kezelésére szolgál, hatását a tumor nekrózis faktor jelátvitel gátlásán keresztül fejti ki. Klasszikus mutációs technikák segítségével ilyen bonyolult fehérjemérnöki feladatok megoldása hosszú évek munkáját igénylő és olykor a lehetetlennel határos küldetés. A fentiek értelmében kijelenthető, hogy a biológiai folyamatokban döntő szerepet betöltő fehérje-fehérje kapcsolatok vizsgálatában és új fehérjék fejlesztésében az irányított evolúciós megközelítés és annak különböző módszerei új dimenziót nyitottak.

2013. május 9.


Források:
Diaz, Juan E, Brett E Howard, Marc S Neubauer, Allison Olszewski, és Gregory A Weiss. 2003. „Exploring Biochemistry and Cellular Biology with Protein Libraries”. Current Issues in Molecular Biology 5 (4) (október): 129–145.

Minshull, J, és W P Stemmer. 1999. „Protein Evolution by Molecular Breeding”. Current Opinion in Chemical Biology 3 (3) (június): 284–290.

Sidhu, Sachdev S, és Shohei Koide. 2007. „Phage display for engineering and analyzing protein interaction interfaces”. Current Opinion in Structural Biology 17 (4) (augusztus): 481–487. doi:10.1016/j.sbi.2007.08.007.

Smith, George P., és Valery A. Petrenko. 1997. „Phage Display”. Chemical Reviews 97 (2) (április 1): 391–410.

Kép



Kapcsolódó cikkeink:

Evolúciós módszerek a fehérjék kölcsönhatásainak vizsgálatában 2. rész – A fág bemutatás

Evolúciós módszerek a fehérjék kölcsönhatásainak vizsgálatában 3. rész – A fág bemutatás alkalmazása szerin proteázok és kanonikus szerin proteáz inhibitorok kölcsönhatásának vizsgálatában


 

Szakács Dávid

2011-ben végeztem az ELTE Biológus mesterszakán. Az ELTE Biológiai Doktori Iskola Szerkezeti biokémia programjának hallgatója vagyok. Munkám során az immunrendszer részét képező komplementrendszer valamint a véralvadásért felelős rendszer szerin proteáz enzimjeit hatékonyan és specifikusan gátló inhibitor molekulák fejlesztésén dolgozom a fág-bemutatás nevű irányított evolúciós módszerrel. Munkámat a TÁMOP 4.2.4.A/1-11-1-2012-0001 Nemzeti Kiválóság Program című kiemelt projektje támogatja. A projekt az Európai Unió támogatásával, az Európai Szociális Alap társfinanszírozásával valósul meg.
Cikk ajánlása » email:
Hozzászólás írása
Hozzászólás
 

Értékelések száma: 8, Cikk értéke (1-10):


Értékelje ezt a cikket! 

Küldő: inf3rno2014-02-10 10:01:56 
Köszönöm a cikket! Nagyon érdekes volt, nem tudtam, hogy a humirát is így tervezték, azt hittem, hogy létező antitestet szekvenáltak.
 

Hirdetés
Email cím:
Jelszó:

Regisztráció »
Elfelejtett jelszó »
Portálunk oldalai megfelelnek az egészségügyi információk megbízhatóságát és hitelességét garantáló HONcode előírásainak. Ezt: itt ellenőrizheti
Portálunk oldalai megfelelnek az egészségügyi információk megbízhatóságát és hitelességét garantáló HONcode előírásainak. Ezt:
itt ellenőrizheti
.
Oldal ajánlása (email):
Az ajánlót küldi (név):
Hirdetés